26 JANVIER 1993. - Arrêté royal relatif à la lutte contre la peste équine (NOTE : Consultation des versions antérieures à partir du 25-09-2009 et mise à jour au 25-09-2009)

Article 1er.La peste équine est une maladie des animaux qui tombe sous l'application du chapitre III de la loi du 24 mars 1987 relative à la santé des animaux.

Sans préjudice des dispositions prises en application de l'article 18, tout traitement thérapeutique ou préventif contre la peste équine, notamment la vaccination, est interdit.

Chapitre 1er.- Définitions.

Art. 2.Pour l'application du présent arrêté, il faut entendre par :

1. exploitation : toute construction ou ensemble de constructions, y compris les terrains annexes qui, pris globalement, constituent une entité au point de vue sanitaire, où sont détenus des équidés ou qui y sont destinés;

2. équidés : les animaux domestiques ou sauvages des espèces équine - y compris les zèbres -, asine ou les animaux issus de leur croisement;

3. responsable : la personne qui exerce une gestion et une surveillance habituelles et directes sur les animaux;

4. vecteur : l'insecte de l'espèce " culicoïdes imicola " ou tout autre insecte du genre culicoïde susceptible de transmettre la peste équine;

5. équidé atteint de peste équine : tout équidé sur lequel la maladie a été officiellement constatée par un examen de laboratoire effectué conformément à l'annexe de cet arrêté par l'institut National de Recherches Vétérinaires, désigné ci-après sous le sigle I.N.R.V.;

6. équidé suspect d'être atteint de peste équine : tout équidé qui présente des symptômes cliniques ou oedèmes permettant de suspecter valablement la peste équine;

7. équidé suspect d'être contaminé de peste équine : tout équidé appartenant à un foyer de peste équine ou ayant quitté depuis moins de 15 jours un foyer de peste équine;

8. foyer de peste équine : l'exploitation dans laquelle se trouve un équidé atteint de peste équine;

9. exploitation suspecte de peste équine : l'exploitation dans laquelle se trouve un équidé suspect d'être atteint ou d'être contaminé de peste équine;

10. Ministre : le Ministre qui a l'Agriculture dans ses attributions;

11. Service : le Service Vétérinaire du Ministère de l'Agriculture;

12. bourgmestre : le bourgmestre de la commune dans laquelle est située l'exploitation.

Chapitre 2.- Suspicion.

Art. 3.Quiconque suspecte ou constate l'existence de peste équine chez un équidé est tenu d'en informer immédiatement l'inspecteur vétérinaire.

Art. 4.Dès qu'il a connaissance d'une suspicion, l'inspecteur vétérinaire :

- se rend immédiatement sur place et procède à l'examen clinique de tous les équidés de l'exploitation;

- effectue ou fait effectuer les prélèvements nécessaires aux examens de laboratoire;

- procède ou fait procéder au recensement officiel des équidés, avec indication, pour chaque espèce, du nombre d'équidés déjà morts, atteints ou suspects d'être atteints et à la mise à jour dudit recensement afin de tenir compte des équidés nés ou morts pendant la période de suspicion; les données de ce recensement devant être produites sur demande et pouvant être contrôlées à chaque visite;

- procède ou fait procéder au recensement des lieux susceptibles de favoriser la survie du vecteur ou de l'héberger, en vérifiant que les moyens appropriés de désinsectisation y sont utilisés;

- procède ou fait procéder à une enquête épidémiologique, conformément à l'article 12;

- notifie au responsable que son exploitation est suspecte de peste équine.

Art. 5.§ 1. L'exploitation suspecte est placée sous surveillance officielle de l'inspecteur vétérinaire et soumise notamment aux mesures suivantes :

- tous les équidés de l'exploitation sont maintenus dans leurs locaux d'hébergement ou dans d'autres lieux protégés contre le vecteur;

- tout mouvement d'équidés en provenance ou à destination de l'exploitation est interdit;

- les moyens appropriés de désinsectisation sont utilisés dans les bâtiments hébergeant les équidés et aux abords de ces bâtiments;

- la sortie de l'exploitation de cadavres d'équidés est interdite, sauf autorisation de l'inspecteur vétérinaire.

§ 2. L'inspecteur vétérinaire peut appliquer les mesures visées au § 1er à d'autres exploitations dans le cas où leur implantation, leur situation géographique ou les contacts avec l'exploitation où la maladie est suspectée permettent de soupçonner une possibilité de contamination.

Art. 6.Dès qu'il résulte des examens que la suspicion de peste équine est infirmée, les mesures en vigueur en vertu de l'article 5 sont levées par l'inspecteur vétérinaire qui en informe le responsable.

Art. 7.L'inspecteur vétérinaire notifie au bourgmestre :

- les exploitations suspectes;

- les mesures applicables à ces exploitations;

- la levée des mesures dans les exploitations suspectes.

Chapitre 3.- Foyer.

Art. 8.Dès que l'existence de peste équine est confirmée, l'exploitation est considérée comme foyer de peste équine.

L'inspecteur vétérinaire en informe le responsable, le médecin vétérinaire agréé de l'exploitation et le bourgmestre.

Art. 9.L'inspecteur vétérinaire effectue ou fait effectuer une enquête épidémiologique conformément à l'article 12.

Art. 10.Outre les mesures visées à l'article 5, § 1er, les mesures suivantes sont prises sans délai dans le foyer :

1. tous les équidés atteints ou suspects d'être atteints de peste équine sont mis à mort et détruits par ordre et sous contrôle de l'inspecteur vétérinaire. L'ordre d'abattage est signifié au responsable et une copie est adressée au bourgmestre;

2. l'inspecteur vétérinaire visite ou fait visiter régulièrement l'exploitation; à cette occasion, chaque équidé sera examiné, on procédera à un examen clinique approfondi ou à l'autopsie des animaux suspects ou morts et on effectuera les prélèvements nécessaires aux examens de laboratoire.

Art. 11.Les mesures dans le foyer sont levées au plus tôt 30 jours après la mise à mort et la destruction du dernier équidé atteint ou suspect d'être atteint de peste équine, et pour autant que les équidés de l'exploitation aient été soumis avec une réaction négative à deux tests de fixation du complément pour la peste équine tel que décrit en annexe du présent arrêté, avec un intervalle compris entre vingt et un et trente jours.

Chapitre 4.- Enquête épidémiologique.

Art. 12.L'enquête épidémiologique porte sur :

- la durée de la période pendant laquelle la peste équine peut avoir existé dans l'exploitation;

- l'origine possible de la peste équine dans l'exploitation et l'identification d'autres exploitations dans lesquelles se trouvent des équidés ayant pu être contaminés à partir de cette même source;

- la présence et la distribution des vecteurs de la maladie;

- les mouvements des équidés à partir ou en direction des exploitations en cause ou la sortie éventuelle des cadavres d'équidés desdites exploitations.

Chapitre 5.- Zone de protection.

Art. 13.Le Service délimite une zone de protection autour du foyer. La délimitation de la zone doit tenir compte des barrières naturelles, des facilités de contrôle, des facteurs géographiques et des facteurs d'ordre écologiques et épidémiologiques liés à la peste équine.

Art. 14.La zone de protection est soumise aux mesures suivantes :

1. le recensement de toutes les exploitations comportant des équidés est effectué;

2. ces exploitations sont soumises à la visite d'un vétérinaire agréé selon les instructions du Service;

3. le maintien des équidés dans l'exploitation dans laquelle ils se trouvent, sauf pour être transportés directement, sous couvert d'un sauf-conduit délivré par le Service, en vue d'un abattage d'urgence dans un abattoir situé dans cette zone ou, si cette zone ne comporte pas d'abattoir, dans un abattoir désigné par le Service.

Chapitre 6.- Dispositions générales.

Art. 15.Lorsque le responsable refuse d'exécuter les mesures ou injonctions, l'inspecteur vétérinaire les fait exécuter l'office.

Art. 16.Tout cas urgent non prévu par le présent arrêté est réglé par l'inspecteur vétérinaire.

Art. 17.Tout médecin vétérinaire agréé doit en matière de peste équine, observer les instructions données par l'inspecteur vétérinaire et lui donner à tout moment les renseignements demandés.

Art. 18.En cas de danger imminent de contamination ou d'extension de peste équine, le Ministre peut prendre toutes mesures de lutte, notamment la vaccination d'urgence, jusqu'à la disparition du danger.

Art. 19.Les infractions aux dispositions du présent arrêté sont recherchées, constatées et punies conformément aux chapitres V et VI de la loi du 24 mars 1987 relative à la santé des animaux.

Art. 20.Le présent arrêté entre en vigueur le jour de sa publication au Moniteur belge.

Art. 21.Notre Ministre de l'Agriculture est chargé de l'exécution du présent arrêté.

Annexe.

Art. N1.Annexe 1. - Peste équine.

Article 1er.N1.[1 DIAGNOSTIC DE LA PESTE EQUINE

Les réactifs pour les techniques immuno-enzymatiques (ELISA) décrites ci-dessous peuvent être obtenus auprès du laboratoire communautaire de référence ou des laboratoires de référence de l'OIE pour la peste équine.

1. TEST ELISA DE COMPETITION POUR DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE)

Le test ELISA de compétition est utilisé pour détecter la présence d'anticorps spécifiques contre le virus de la peste équine dans les sérums de toute espèce d'équidés. L'antisérum de cobaye contre le VPE, ci-après dénommé "antisérum de cobaye", est un antisérum A large spectre, polyclonal et immun; il est spécifique du sérogroupe PE et permet de détecter tous les sérotypes connus du virus de cette maladie.

Le principe du test est une diminution de la réaction entre l'antigène du VPE et un antisérum de cobaye par un échantillon de sérum A tester. Les anticorps du VPE dans l'échantillon de sérum A tester seront en compétition avec ceux de l'antisérum de cobaye, ce qui entraînera une réduction de la couleur attendue (après ajout d'un anticorps anticobaye marqué par un enzyme et du substrat). Les sérums peuvent être testés A une seule dilution de 1/5 (méthode du test ponctuel) ou être titrés (méthode de titrage du sérum), pour donner les points terminaux de dilution. Des valeurs d'inhibition supérieures A 50 % peuvent être considérées comme positives.

Le protocole du test décrit ci-dessous est utilisé par le laboratoire régional de référence pour la peste équine de Pirbright, Royaume-Uni.

1.1. Description du test

1.1.1. Préparation des plaques

1.1.1.1. Déposer sur des plaques ELISA de l'antigène du VPE extrait de cultures de cellules infectées, dilué dans un tampon carbonate-bicarbonate de pH 9,6. Incuber les plaques ELISA pendant une nuit A 4°C.

1.1.1.2. Laver les plaques trois fois par rinçage et vider les puits avec une solution saline tamponnée au phosphate (SSTP) de pH 7,2-7,4, puis sécher au buvard.

1.1.2. Puits de contrôle

1.1.2.1. Titrer les sérums de contrôle positifs dans une série de dilutions de 2 en 2, de 1/5 A 1/640, dans la colonne 1, dans un tampon de blocage SSTP contenant 0,05 % (v/v) de Tween-20, 5,0 % (m/v) de lait écrémé en poudre (Cadbury's Marvel.

TM ) et 1 % (v/v) de sérum bovin adulte, afin d'obtenir un volume final de 50 æl par puits.

1.1.2.2. Ajouter 50 æl de sérum de contrôle négatif A une dilution de 1/5 (10 æl de sérum + 40 æl de tampon de blocage) aux puits A et B de la colonne 2.

1.1.2.3. Ajouter 100 æl par puits de tampon de blocage aux puits C et D de la colonne 2 (CONTROLE A BLANC).

1.1.2.4. Ajouter 50 æl de tampon de blocage aux puits E, F, G et H de la colonne 2 (contrôle sérum de cobaye).

1.1.3. Méthode du test ponctuel

1.1.3.1. Ajouter au tampon de blocage une dilution A 1/5 de chaque sérum A tester afin de doubler les puits des colonnes 3 A 12 (sérums de 10 æl + 40 æl de tampon de blocage).

ou

1.1.4. Méthode de titrage du sérum

1.1.4.1. Préparer une série de dilutions de 2 en 2 de chaque échantillon A tester (de 1/5 A 1/640) dans un tampon de blocage dans huit puits de chacune des colonnes 3 A 12.

ensuite

1.1.5. Ajouter 50 æl d'antisérum de cobaye, préalablement dilué dans le tampon de blocage, A l'ensemble des puits, excepté les puits DE CONTROLE A BLANC de la plaque ELISA (tous les puits contiennent A présent un volume final de 100 æl).

1.1.5.1. Incuber pendant 1 heure A 37°C dans un agitateur rotatif.

1.1.5.2. Laver les plaques trois fois et sécher comme précédemment.

1.1.5.3. Ajouter A chaque puits 50 æl de sérum de lapin anticobaye conjugué A de la peroxydase de raifort, préalablement dilué dans un tampon de blocage.

1.1.5.4. Incuber pendant 1 heure A 37°C dans un agitateur rotatif.

1.1.5.4. Laver les plaques trois fois et sécher comme précédemment.

1.1.6. Chromogène

Préparer la solution chromogène OPD (OPD = orthophényldiamine) selon les instructions du fabricant (0,4 mg/ml dans de l'eau distillée stérile) juste avant de l'utiliser. Ajouter un substrat (peroxyde d'hydrogène = H 2 O 2 ), afin d'obtenir une concentration finale de 0,05 % (v/v) (1/2000 d'une solution A 30 % de H 2 O 2 ). Ajouter 50 æl de la solution OPD A chaque puits et laisser les plaques sur la paillasse pendant 10 minutes A température ambiante. Stopper la réaction en ajoutant 50 æl par puits d'acide sulfurique 1M (H 2 SO 4 ).

1.1.7. Lecture

Lecture par spectrophotométrie A 492 nm.

1.2. Expression des résultats

1.2.1. A l'aide éventuelle d'un logiciel, déterminer les valeurs de densité optique (DO) et le pourcentage d'inhibition (PI) des sérums A tester et des sérums de contrôle, sur la base de la valeur moyenne enregistrée dans les quatre puits contenant les sérums-contrôles de cobaye. Les valeurs DO et PI sont utilisées pour déterminer si le test a été exécuté dans les limites acceptables. Les limites supérieures et inférieures des sérums-contrôles de cobaye se situent respectivement entre les valeurs 1,4 et 0,4 de DO.

Le titre du point terminal du contrôle positif sur la base d'un PI de 50 % devrait être de 1/240 (entre 1/120 A 1/480). Toute plaque non conforme aux critères précités doit être rejetée. Toutefois, si le titre du sérum de contrôle positif est supérieur A 1/480 et que les échantillons testés sont toujours négatifs, les échantillons réputés négatifs peuvent être acceptés.

Les puits de sérum de contrôle négatif dédoublés et les puits de contrôle A blanc dédoublés devraient présenter des valeurs PI comprises respectivement entre + 25 % et - 25 % et entre + 95 % et + 105 %. Le non-respect de ces limites n'a pas pour effet d'invalider les résultats de la plaque, mais il laisse supposer la formation d'une couleur de bruit de fond.

1.2.2. Le seuil de diagnostic (valeur limite) pour les sérums testés est de 50 % (PI 50 %). Les échantillons donnant des valeurs PI supérieures A 50 % sont considérés comme positifs. Les échantillons donnant des valeurs PI inférieures A 50 % sont considérés comme négatifs.

Les échantillons qui présentent des valeurs PI supérieures ou inférieures au seuil pour les puits dédoublés sont considérés comme douteux. Ces échantillons peuvent être retestés par test ponctuel ou par titrage. Les échantillons positifs peuvent également être titrés afin de fournir une indication du degré de positivité.

Analyse ponctuelle

C - = contrôle négatif.

C + = contrôle positif.

CC = contrôle de cobaye.

Titrage du sérum

C - = contrôle négatif.

C + = contrôle positif.

CC = contrôle de cobaye.

2. TEST ELISA INDIRECT POUR DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE)

Le test décrit ci-après est conforme A la description du chapitre 2.1.11 du manuel des normes pour les tests de diagnostic et les vaccins de l'OIE, quatrième édition, 2000.

La protéine recombinante VP7 a été utilisée comme antigène pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre le virus de la peste équine; la méthode est très sensible et très spécifique. Cette protéine présente également l'avantage d'être stable et non infectieuse.

2.1. Description du test

2.1.1. Phase solide

2.1.1.1. Des plaques ELISA sont sensibilisées avec la protéine recombinante VP7 du VPE de sérotype 4, diluée dans du tampon carbonate/bicarbonate de pH 9,6. Incuber les plaques pendant une nuit A 4°C.

2.1.1.2. Rincer les plaques 5 fois avec de l'eau distillée contenant 0,01 % (v/v) de Tween-20 (solution de lavage). Secouer doucement les plaques sur un matériel absorbant pour enlever toute trace de rinçage.

2.1.1.3. Saturer les plaques avec une SSTP + 5 % (m/v) de lait écrémé en poudre (lait Nestlé.

TM ), A raison de 200 æl par puits pendant 1 heure A 37°C.

2.1.1.4. Enlever la solution de saturation et secouer doucement les plaques sur un matériel absorbant.

2.1.2. Echantillons

2.1.2.1. Les sérums A tester et les sérums positif et négatif de contrôle sont dilués au 1/25 dans une SSTP + 5 % (m/v) de lait écrémé + 0,05 % (v/v) de Tween-20; ils sont ensuite déposés A raison de 100 æl par puits. Incuber pendant 1 heure A 37°C.

Pour le titrage, réaliser des séries de dilution de 2 en 2 A partir du 1/25.e (100 æl/puits), en utilisant une colonne de la plaque par sérum; réaliser la même chose avec les contrôles positif et négatif. Incuber pendant 1 heure A 37°C.

2.1.2.2. Rincer les plaques comme décrit A l'étape 2.1.1.2.

2.1.3. Conjugué

2.1.3.1. Déposer 100 æl/puits des anticorps anti-cheval conjugués A la peroxydase de raifort; ces anticorps sont dilués dans une SSTP + 5 % de lait écrémé + 0,05 % de Tween-20 de pH 7,2. Incuber pendant 1 heure A 37°C.

2.1.3.2. Rincer les plaques comme décrit A l'étape 2.1.1.2.

2.1.4. Chromogène/substrat

2.1.4.1. Ajouter 200 æl /puits de la solution de chromogène/substrat [10 ml de 80,6 mM de DMAB (diméthylaminobenzaldéhyde) + 10 ml de 1,56 mM de MBTH (3-méthyl-2-benzothiazoline d'hydrochlorure d'hydrazone) + 5 æl de H 2 O 2 ].

Bloquer après environ 5 A 10 minutes (avant que le contrôle négatif ne commence A se colorer) la réaction colorimétrique en ajoutant 50 æl de H 2 S0 4 3N.

D'autres chromogènes tels que le ABTS (2,2'-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique), le TMB (tétraméthyle de benzidine) ou l'OPD (ortho-phényldiamine) peuvent aussi être utilisés.

2.1.4.2. Lire la plaque A 600 nm (ou 620 nm).

2.2. Interprétation des résultats

2.2.1. Calculer la valeur du seuil par addition de 0,6 A la valeur du contrôle négatif (0,6 est 1'écart type calculé A partir d'un groupe de 30 sérums négatifs).

2.2.2. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance inférieure au seuil sont considérés comme négatifs.

2.2.3. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance plus grande que le seuil + 0,15 sont considérés comme positifs.

2.2.4. Les échantillons testés donnant une valeur d'absorbance intermédiaire sont douteux et une deuxième technique doit être employée pour confirmer le résultat.

3. TEST ELISA BLOQUANT VISANT A DETECTER LA PRESENCE D'ANTICORPS DIRIGES CONTRE LE VIRUS DE LA PESTE EQUINE (VPE) (TEST OBLIGATOIRE)

Le test ELISA bloquant est destiné A déceler la présence d'anticorps spécifiques contre le virus de la peste équine dans les sérums de toute espèce sensible. La VP7 constitue la protéine antigénique principale du VPE; elle est présente dans les 9 sérotypes. Du fait que l'anticorps monoclonal est également dirigé contre la protéine VP7, le test sera très sensible et très spécifique. En outre, l'antigène recombinant VP7 est totalement inoffensif et très sûr.

Le principe du test est la diminution de la réaction entre la protéine recombinante VP7, en tant qu'antigène lié A la plaque ELISA, et l'anticorps monoclonal conjugué, spécifique de la protéine VP7. Les anticorps dans les sérums A tester bloqueront la réaction entre l'antigène et l'anticorps monoclonal, ce qui entraînera une réduction de la couleur.

Le test décrit ci-dessous est utilisé par le laboratoire communautaire de référence pour la peste équine de Algete, Espagne.

3.1. Description du test

3.1.1. Plaques ELISA

3.1.1.1. Déposer sur des plaques ELISA de 1'antigène du VPE de sérotype 4 avec la protéine recombinante VP7, diluée dans un tampon carbonate/bicarbonate de pH 9,6, et incuber pendant une nuit A 4°C.

3.1.1.2. Laver les plaques 5 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (SSTP) contenant 0,05 % (v/v) de Tween-20.

3.1.1.3. Stabiliser la plaque par traitement A 1'aide d'une solution de stabilisation (pour permettre un stockage A long terme A 4°C sans perte d'activité) et sécher au buvard.

3.1.2. Echantillons et contrôles

3.1.2.1. Criblage: Diluer les sérums A tester et les contrôles dans la proportion de 1 A 10 directement sur la plaque dans la SSTP afin d'obtenir un volume final de 100 æl par puits. Incuber pendant 1 heure A 37°C.

3.1.2.2. Titrage: Préparer une série de dilutions de 2 en 2 de sérums A tester et de contrôles positifs (100 æl par puits) de 1/10 A 1/1280 A déposer dans huit puits. Le contrôle négatif est testé A une dilution de 1/10.

3.1.3. Conjugué

Ajouter 50 æl d'anticorps monoclonal préalablement dilué (anticorps monoclonal conjugué avec la peroxydase du raifort) dans chaque puits et mélanger doucement afin de garantir l'homogénéité. Incuber pendant 30 minutes A 37°C.

3.1.4. Laver les plaques 5 fois A l'aide de SSTP et sécher au buvard comme décrit ci-dessus.

3.1.5. Chromogène/substrat

Ajouter 100 æl par puits de la solution suivante de chromogène/substrat: 1 ml de ABTS (2,2-azino-bis-[3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulphonique]) A 5 mg/ml + 9 ml de tampon de substrat (0,1M de tampon de phosphate-citrate de pH 4 contenant 0,03 % de H 2 O 2 ), puis incuber pendant 10 minutes A température ambiante. Le développement de la couleur est arrêté par l'addition de 100 æl par puits de SDS (sulfate de sodium dodécyl) A 2 % (m/v).

3.1.6. Lecture

Lire A 405 nm dans un lecteur ELISA.

3.2. Interprétation des résultats

3.2.1. Validité du test

Le test est valable lorsque la densité optique (DO) du contrôle négatif (CN) est supérieure A 1,0 et que la DO du contrôle positif (CP) est inférieure A 0,2.

3.2.2. Calcul des limites

Limite positive = CN - ((CN - CP) x 0,3)

Limite négative = CN - ((CN - CP) x 0,2)

CN est la DO du contrôle négatif et CP est la DO du contrôle positif.

3.2.3. Interprétation des résultats

Dans la recherche d'anticorps contre le VPE, les échantillons présentant des DO inférieures A la limite positive doivent être considérés comme positifs.

Dans la recherche d'anticorps contre le VPE, les échantillons présentant des DO supérieures A la limite positive doivent être considérés comme négatifs.

Les échantillons présentant des DO comprises entre ces deux valeurs doivent être considérés comme douteux et des échantillons doivent être prélevés de nouveau sur les animaux après 2 A 3 semaines.

----------

(1AR 2009-06-28/47, art. 1, 002; En vigueur : 05-10-2009)