Article 1er.Les résidus de substances à effet bactériostatique sont recherchés par les méthodes, appropriées aux diverses espèces de viandes, graisses et abats et reprises en annexe au présent arrêté.
Art. 2.Le présent arrêté entre en vigueur le jour de sa publication au Moniteur belge.
Art. N1.<AM 1995-06-19/34, art. 1, 002; En vigueur : 01-10-1995> Annexe.
Test rénal sur les animaux de boucherie.
1. But.
La méthode décrite permet la mise en évidence de la présence des résidus de substances à effet bactériostatique dans les animaux de boucherie abattus lors de l'expertise post mortem dans les abattoirs. L'examen doit être réalisé aussitôt que possible après abattage et au plus tard dans les douze heures après celui-ci. Si ce délai ne peut être respecté, les reins doivent être congelés immédiatement après le prélèvement. L'expert prend les mesures nécessaires pour l'identification des reins.
2. Principe.
Un morceau de cortex rénal et deux disques de papier imprégnés du liquide rénal sont déposés sur une plaque de milieu de culture contenant un germe sensible aux substances bactériostatiques. Après incubation, la présence d'une activité bactériostatique autour des deux disques de papier et du morceau de cortex rénal indique la présence de substances à effet bactériostatique.
3. Germe test.
Spores de Bacillus subtillis BGA en suspension : 10 exposant 7 spores/ml (Merck 10649 ou équiv.).
4. Milieu de culture et réactifs.
4.1. Milieu de culture : agar test pH 7,2 pour le test d'inhibition (Merck 15787 ou équiv.).
4.2. Dextrose.
4.3. Méthanol pour analyse.
4.4. Solution de triméthoprim (TMP) : préparer une solution contenant 1 mg TMP/ml de méthanol. Cette solution est stable 6 mois au frigo à 4° C.
4.5. Disques de contrôle.
Disque 1 : 1 mcg de tylosine/disque.
Disque 2 : 1 mcg de sulfadimidine/disque.
Disque 3 : 1 mcg d'oxytétracycline/disque.
Disque 4 : 1 mcg de streptomycine/disque.
4.6. Acide chlorhydrique : 1 M.
4.7. Hydroxyde de sodium : 1 M.
5. Appareils. verrerie et accessoires.
Instruments et verrerie habituellement employés dans un laboratoire de microbiologie et en particulier :
5.1. Boîtes de Pétri stériles de 9 cm de diamètre.
5.2. Bouteilles stérilisables de 250, 500, 1 000 ml.
5.3. Verre à pied gradué de 250 ml, graduation à 1 ml.
5.4. Autoclave.
5.5. Bain-marie réglé à 48° C +/-1° C.
5.6. Etuve réglée à 30° C +/-1° C.
5.7. Emporte-pièce de 8 mm de diamètre, bistouri et pinces.
5.8. Disque en papier de 12,7 mm de diamètre (Schleicher et Schull art. 601/2 ou équiv.).
5.9. Pipettes.
5.10. Table horizontale pour verser le milieu de culture.
6. Préparation du milieu de culture.
Peser la quantité nécessaire de milieu de culture (4.1.), ajouter 0,4 % de dextrose et dissoudre avec la quantité d'eau distillée requise. Stériliser le milieu de culture pendant 15 minutes à 121° C +/-1° C. Refroidir à 48° C au bain-marie. Le pH du milieu prêt à l'emploi doit être de 7,2 +/- 0,1 à 25°C. Ajuster celui-ci, éventuellement à l'aide de l'acide chlorhydrique (4.6.) ou de la solution d'hydroxyde de sodium (4.7.). Ajouter immédiatement avant la préparation des boîtes de Pétri la quantité adéquate de triméthoprim (0,2 mcg/ml agar) et 0,1 % (3.)(V/V) de la suspension de spores au milieu de culture. Répartir 14 ml de gélose dans les boîtes de Pétri de 9 cm de diamètre de façon à obtenir une épaisseur uniforme de 2 mm. Après durcissement du milieu de culture, les boîtes de Pétri fermées sont emballées dans des sacs plastiques et conservées, le couvercle vers le bas pendant maximum une semaine au frigo à 4° C.
7. Méthode.
7.1. Contrôle de sensibilité.
Avant chaque série d'analyse ou après la préparation d'un nouveau lot de boîtes de Pétri, déposer sur la gélose quatre disques de contrôle contenant respectivement 1 mcg de tylosine, 1 mcg d'oxytétracycline, 1 mcg de sulfadimidine et 1 mcg de streptomycine (4.5.). Incuber la boite de Pétri à 30° C pendant 16-24 heures. Mesurer les diamètres des zones d'inhibition nettes, y compris le disque de contrôle.
7.2. Réalisation du test.
Inciser profondément le rein à partir du cortex rénal. Déposer 2 disques de papier (5.8.) dans l'incision juste au-dessus du bassinet. Refermer l'incision, comprimer légèrement le rein et laisser les disques s'imprégner totalement du liquide rénal. Les disques sont retirés du rein à l'aide d'une pince et placés en diagonale sur la gélose (6.). Prélever à l'aide de l'emporte-pièce un morceau de cortex rénal, découper à l'aide d'un bistouri un morceau d'au moins 2 mm d'épaisseur et le déposer à l'aide d'une pince sur la gélose à proximité des disques. La boîte de Pétri est incubée dans l'étuve à 30° C +/-1° C pendant 16-24 heures. Mesurer le diamètre des zones d'inhibition nettes, le disque y compris ainsi que la largeur de la zone d'inhibition autour du morceau de cortex rénal.
8. Interprétation des résultats.
8.1. Disques de contrôle.
Pour que la sensibilité du test soit considérée comme valable les disques de contrôle doivent engendrer des zones d'inhibition d'un diamètre d'au moins :
20 mm pour disque 1 1 mcg de tylosine
17 mm pour disque 2 1 mcg de sulfadimidine
18 mm pour disque 3 1 mcg d'oxytetracycline
20 mm pour disque 4 1 mcg de streptomycine8.2. Echantillons.
Le test est considéré comme positif si la moyenne des diamètres des deux zones d'inhibition, le disque y compris est égale ou supérieure à 20 mm ou quand la largeur de la zone d'inhibition autour du morceau de cortex rénal est égale ou supérieure à 2 mm.
9. Contre expertise.
Une partie du rein utilisé doit être congelée immédiatement après l'exécution du test et tenue à la disposition du contre expert éventuel.